Endotoksiner og påvisning av disse

Nyttige fakta om endotoksiner og påvisning av disse ved hjelp av Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assays

Endotoksin (lipo-poly-sakkarid, LPS) produseres kun av Gram-negative bakterier som Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa og mange flere. Konsentrasjonen av endotoksin angis i EU.

1 EU = 100 pg endotoksin.

1 pikogram = 10-12 gram eller 0,000000000001 gram

For én spesifikk stamme av Gram-negative bakterier er det fastslått at omtrent 700 bakterieceller inneholder 1 EU
(Scan Dia Labs, upubliserte data).


Mekanismer for frigivelse av LPS fra Gram-negative bakterieceller:

 

 

Naturlig celledød og bateriolyse

LPS-løsrivelse via frigivelse av bleb eller membranvesikkel

Serumprotein- og komplement-mediert frigivelse

Vertsfagosytt-innføring med påfølgende eksocytose av LPS Antibiotikum-mediert frigivelse

   

LAL-analyser (Limulus Amoebocyte Lysate) for påvisning av endotoksin:

 

Gelkoagel-teknikk

Lite sensitivitetsområde og kun semikvantitativt på sitt beste.
Maks. sensitivitet: 0,03 EU/ml.

 

Kromogene analyser bruker et syntetisk kromogent peptid som substrat for koaguleringsenzymet i stedet for koagulogen. Det kromogene substratet hydrolyseres av koaguleringsenzymet, noe som frigir den terminale, kromogene halvdelen med gul farge. Maks. sensitivitet > 0,01 EU/ml.

  • Kromogene og endepunkt-turbidimetriske teknikker

 

Kinetisk-turbidimetrisk teknikk

Måler frekvensen til LAL-LPS-reaksjonen eller hvor lang tid det tar for reaksjonen å nå en spesifisert optisk tetthet. Kvantitativ. Forenkler evaluering av prøveinhibering/-forsterkning. Maks. sensitivitet: > 0,005 EU/ml.

Den ikke-konkurrerende ELISA-analysen med C-peptid og Sandwich ELISA-analysen med monoklonale antistoffer, samt den rakett-immunelektroforetiske analysen for måling av kvantitativt konsum av koagulogen ved hjelp av kanin-antistoffer mot proteinet, eller alle elegante teknikker. Kompliserte og tidkrevende klargjøringsprosedyrer forhindrer imidlertid utstrakt bruk av disse.

  • ELISA-teknikker og rakett-immunelektroforetisk teknikk

Mekanismer for interferens på LAL-analyser:
Suboptimale pH-forhold
Aggregering eller adsorpsjon av kontrollendotoksin-spisser
Upassende kationkonsentrasjoner
Enzym- eller proteinmodifisering
Ikke-spesifikk LAL-aktivering - noen ganger kan ikke en interferensmekanisme fastslås

Head Office & Central Laboratory:
Scan Dia Labs ApS
KELLERSHUS
Brejning Strand 1 E
DK - 7080 Børkop
Denmark
Tel: (+45) 3963 4855
mail@scandialabs.com