Endotoxine und ihre Bestimmung

Nützliche Informationen über Endotoxine und ihre Bestimmung mit hilfe von Limulus-Amöbozyten-Lysat-Tests (LAL-Tests)

Endotoxin (LipoPolySaccharid, LPS) wird ausschließlich von gramnegativen Bakterien hergestellt. Dazu gehören zum Beispiel Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa und zahlreiche weitere Arten. Die Endotoxinkonzentration wird in EU angegeben.


1 EU = 100 pg Endotoxin.

1 Pikogramm = 10-12 Gramm oder 0,000000000001 Gramm


Bei einem spezifischen gramnegativen Bakterienstamm wurde festgestellt, dass ca. 7000 Bakterienzellen 1 EU enthalten (unferöffentlichte Daten der Scan Dia Labs).

 

Mechanismen der LPS-Freisetzung aus gramnegativen

Bakterienzellen:

Natürliches Absterben der Zellen sowie Bakteriolyse

LPS-Ausschüttung durch Bläschen- oder Membranvesikelfreisetzung

Freisetzung durch Serumprotein und Komplemente

Wirtsphagozytose mit anschließender LPS-Exozytose Freisetzung durch Antibiotika



Limulus-Amöbozyten-Lysat-Tests (LAL-Tests) zur Endotoxinbestimmung:


Gel-Clot-Methode

Kleiner Empfindlichkeitsbereich, bestenfalls semi-quantitativ.

Max. Empfindlichkeit: 0,03 EU/ml.

Chromogene und turbidimetrische Endpunktmethoden

Bei den chromogenen Testverfahren wird anstelle von Koagulogen ein synthetisches, chromogenes Peptid als Substrat für das Gerinnungsenzym verwendet. Das chromogene Substrat wird durch das Gerinnungsenzym hydrolysiert und setzt dabei den terminalen chromogenen Molekülrest frei. Dieser ist gelb. Empfindlichkeit: >0,01 EU/ml.

Misst die Geschwindigkeit der LAL-LPS-Reaktion bzw. die Zeit, die die Reaktion zum Erreichen einer spezifischen optischen Dichte benötigt. Quantitativ. Erleichtert die Einschätzung der Hemmung/Verstärkung der Probe. Empfindlichkeit: >0,005 EU/ml.

  • Kinetisch-turbidimetrische

Methode
Elegante Bestimmungsmethoden sind der nicht-kompetitive C-Peptid-ELISA und der Sandwich-ELISA, bei denen monoklonale Antikörper verwendet werden, sowie die Rocket-Immunoelektrophorese, bei der unter Verwendung von Kaninchen-Antikörpern der quantitative Verbrauch von Koagulogen gemessen wird. Aufgrund ihrer komplizierten und zeitaufwändigen Einrichtung werden diese Methoden jedoch selten eingesetzt.

  • ELISA-Methoden und Rocket-Immunoelektrophorese

Interferenzmechanismen der LAL-Tests:
Suboptimale pH-Bedingungen
Ansammlung oder Adsorption von Kontroll-Endotoxin-Spikes
Ungeeignete Kationenkonzentrationen Enzym- oder Proteinveränderung
Unspezifische LAL-Aktivierung - in manchen Fällen ist es nicht möglich, einen Interferenzmechanismus zu bestimmen.

Head Office & Central Laboratory:
Scan Dia Labs ApS
KELLERSHUS
Brejning Strand 1 E
DK - 7080 Børkop
Denmark
Tel: (+45) 3963 4855
mail@scandialabs.com