Endotoxiner och detektion av dessa

Viktiga fakta om endotoxiner och detektion av dessa med Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assays

Endotoxin (lipopolysackarid, LPS) produceras enbart av gramnegativa bakterier, t.ex. Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, och många, många fler. Endotoxinkoncentrationen uttrycks i EU.

 

1 EU = 100 pg endotoxin

 

1 pikogram = 10-12 gram eller 0,000000000001 gram

För en specifik stam av gramnegativa bakterier har det fastställts att omkring 7 000 bakterieceller innehåller 1 EU
(Scan Dia Labs, opublicerade uppgifter).



Mekanismer för LPS-frisättning från gramnegativa bakterieceller:

 

 

Naturlig celldöd och bakteriolys

LPS-utsöndring via frisättning från blåsor eller membranvesikler
Serumproteinfrisättning och komplementmedierad frisättning
Värdfagocytos med efterföljande exocytos och
LPS-frisättning genom antibiotika

 

Limulus amöbocyt lysat-analyser (LAL-analyser) för detektion av endotoxin:

 

Gel-Clot-metod

Smalt känslighetsintervall och endast semikvantitativt som bäst.

Max. känslighet: 0,03 EU/ml.

Kromogena och endpoint-turbidimetriska metoder

De kromogena analyserna använder en syntetisk kromogen peptid som substrat för koagulationsenzymet i stället för koagulationsprotein. Det kromogena substratet hydrolyseras av koagulationsenzymet och frisätter den slutliga kromogena delen med en gul färg. Max. känslighet >0,01 EU/ml.

 

Kinetisk-turbidimetrisk metod

Bestämmer hastigheten för LAL-LPS-reaktionen eller den tid som behövs för att reaktionen ska nå en specificerad optisk densitet. Kvantitativ. Underlättar bedömning av hämning/
förstärkning av provet. Max. känslighet: >0,005 EU/ml.


Icke-kompetitiv C-peptid-ELISA och Sandwich-ELISA som använder monoklonala antikroppar, samt raketimmunelektro-foretisk analys som mäter den kvantitativa förbrukningen av koagulationsprotein med hjälp av antikroppar från kanin, är alla förfinade metoder. Komplicerade och tidskrävande inställningsprocedurer hindrar dem dock från att användas i större utsträckning.

 

Störningsmekanismer för LAL-analys:

Suboptimala pH-förhållanden

Aggregation eller adsorption av kontrollendotoxintoppar

Olämpliga katjonkoncentrationer

Enzym- eller proteinmodifiering

Icke-specifik LAL-aktivering - ibland kan en störningsmekanism inte fastställas

  • ELISA-metoder och raket-immunelektroforetisk metod

Head Office & Central Laboratory:
Scan Dia Labs ApS
KELLERSHUS
Brejning Strand 1 E
DK - 7080 Børkop
Denmark
Tel: (+45) 3963 4855
mail@scandialabs.com