Определение эндотоксинов

 

Полезные сведения об эндотоксинах и их определении с помощью анализа на основе лизата амебоцитов Limulus (LAL-теста)

 

Эндотоксин (липополисахарид, ЛПС) образуется исключительно грамотрицательными бактериями, такими как Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa и многими другими. Концентрация эндотоксина выражается в ЕЭ (единицах эндотоксина).

 

1 ЕЭ = 100 пг эндотоксина.

1 пикограмм = 10-12 грамм, или 0,000000000001 грамма.

 

Для одного определенного штамма грамотрицательных бактерий было установлено, что 1 ЕЭ содержится примерно в 7000 бактериальных клетках (Scan Dia Labs, данные не опубликованы).

 

Механизмы высвобождения ЛПС из клеток грамотрицательных бактерий:

Естественная смерть клеток и бактериолиз

Выделение ЛПС путем высвобождения из мембранных пузырьков

Высвобождение, опосредованное белками сыворотки или системой комплемента

Поглощение фагоцитами хозяина с последующим экзоцитозом ЛПС

Высвобождение, опосредованное антибиотиками

 

Анализ на основе лизата амебоцитов Limulus (LAL-тест) для определения эндотоксинов:

 

• Гель-тромб тест

Узкий диапазон чувствительности и в лучшем случае полуколичественный характер.

Максимальная чувствительность: 0,03 ЕЭ/мл.

 

• Хромогенный тест и турбидиметрический тест по конечной точке

Хромогенный анализ основан на использовании хромогенного пептида в качестве субстрата для свертывающего фермента вместо коагулогена. Хромогенный субстрат расщепляется свертывающим ферментом, что приводит к высвобождению концевой хромогенной части молекулы, обусловливающей желтое окрашивание раствора. Максимальная чувствительность: >0,01 ЕЭ/мл.

 

• Кинетический турбидиметрический тест

Измеряется скорость реакции LAL-ЛПС или время, необходимое для достижения определенной оптической плотности. Количественный метод. Облегчает оценку эффектов подавления/активации образца. Максимальная чувствительность: >0,005 ЕЭ/мл.

 

• Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и ракетный иммуноэлектрофорез

Неконкурентный твердофазный ИФА С-пептида и иммуноферментный

сэндвич-анализ, в которых применяются моноклональные антитела, и

ракетный иммуноэлектрофоретический анализ, измеряющий количество

потребляемого коагулогена, в котором используются кроличьи антитела к

этому белку, - превосходные методы анализа. Однако сложная и

длительная процедура подготовки ограничила широкое распространение

этих методик. Однако сложная и длительная процедура подготовки ограничила широкое распространение этих методик.

 

Механизмы интерференции LAL-теста:

Субоптимальные значения рН

Агрегация или адсорбция пиков контрольного эндотоксина

Определенные несоответствующие концентрации катионов

Модификации ферментов или белков

Неспецифическая активация LAL-реактива – в некоторых случаях механизм интерференции установить невозможно

 

Head Office & Central Laboratory:
Scan Dia Labs ApS
KELLERSHUS
Brejning Strand 1 E
DK - 7080 Børkop
Denmark
Tel: (+45) 3963 4855
mail@scandialabs.com