Informatie over endotoxinen

Informatie over endotoxinen en de detectie ervan met behulp van Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assays

Endotoxinen (lipopolysacchariden, LPS) worden uitsluitend geproduceerd door Gram-negatieve bacteriën, zoals bijvoorbeeld Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa en vele andere. De endotoxineconcentratie wordt uitgedrukt in EU.

 

 

1 EU = 100 pg endotoxine.

 

1 pikogram = 10-12 gram of 0,000000000001 gram

 

 

Van één bepaalde stam Gram-negatieve bacteriën is berekend dat ongeveer 7000 bacteriecellen 1 EU bevatten

(Scan Dia Labs, ongepubliceerde gegevens).


Mechanismen voor het vrijmaken van LPS uit Gram-negatieve bacteriecellen:

 

 

Natuurlijke celsterfte en bacteriolyse

LPS-lysis via blaren of membraanvesikels

 

Serumproteïne- en complementafhankelijke lysis
Ingestie door fagocyten van de gastheer met aansluitende exocytose van LPS antibiotica-gemedieerde lysis

 

 

 

 

De Limulus Amoebocyte Lysaat (LAL)-test voor de detectie van endotoxinen:

 

Gel-clot techniek

Beperkt gevoeligheidsbereik en hoogstens semi-kwantitatief

Max. gevoeligheid: 0,03 EU/ml.

 

De chromogene tests maken gebruik van synthetische chromogene peptiden als substraat voor het stollingsenzym in plaats van coagulogen. Het chromogene substraat wordt door het stollingsenzym gehydrolyseerd, waarbij het terminale chromogene deel met een gele kleur wordt gelyseerd. Max. gevoeligheid >0,01 EU/ml.

 

 

Kinetische turbidimetrische techniek

Deze techniek meet de snelheid van de LAL-LPS-reactie of de tijd tot de reactie een bepaalde vertroebeling bereikt. Kwantitatief. Maakt beoordeling van de inhibitie/verbetering van het sample mogelijk. Max. gevoeligheid: >0,005 EU/ml.

De non-competitieve C-peptide-ELISA en de sandwich-ELISA maken gebruik van monoclonale antilichamen; de rocket-immuno-elektroforese meet de kwantitatieve opname van coagulogen met behulp van antilichamen van konijnen tegen het eiwit. Deze methoden zijn uitstekend, maar de gecompliceerde en tijdrovende opstelling maakt wijdverbreid gebruik onmogelijk.

 

 

Storingsfactoren bij LAL-tests:

Suboptimale pH-voorwaarden.
LPS-lysis via blaren of membraanvesikels.

Ongeschikte kationenconcentraties.
Modificaties van enzymen of proteïnen.
Non-specifieke LAL-activering - soms kan een storingsfactor niet worden achterhaald.

  • ELISA-technieken en rocket-immuno-elektroforese

  • Chromogene methode en turbidimetrische eindpuntmethode

Head Office & Central Laboratory:
Scan Dia Labs ApS
KELLERSHUS
Brejning Strand 1 E
DK - 7080 Børkop
Denmark
Tel: (+45) 3963 4855
mail@scandialabs.com