Las endotoxinas y su detección

Información útil sobre las endotoxinas y su detección con las pruebas Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

La endotoxina (lipopolisacárido, LPS) es producida exclusivamente por bacterias Gram negativas, como por ejemplo, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa y otras muchas. La concentración de endotoxinas se expresa en UE.

 


1 UE = 100 pg de endotoxina

1 picogramo = 10-12 gramo ó 0,000000000001 gramo.

 


Se ha determinado que, aproximadamente 7.000 células bacterianas de una cepa específica de bacterias Gram negativas contienen 1 unidad de endotoxina (Scan Dia Labs, datos sin publicar).

 


Mecanismos de liberación de LPS de las células bacterianas Gram negativas:

Muerte celular natural y bacteriólisis

Liberación de LPS a través de bulbo o vesícula de membrana

Liberación de proteína de suero y mediación por un complemento

Ingestión de fagocitos huésped con la consecuente exocitosis de LPS Liberación mediada por antibiótico

 


Pruebas Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) para la detección de endotoxinas:

 

 

Método Gel-Clot

Rango de sensibilidad reducido y como máximo semicuantitativo. Sensibilidad máxima: 0,03 E/ml

En las pruebas cromogénicas se emplea un péptido cromogénico sintético en lugar de coagulógeno como sustrato para la encima coagulante. El sustrato cromogénico es hidrolizado por la encima coagulante, liberando la fracción cromogénica terminal de color amarillo. Sensibilidad: >0,01 UE/ml

 

Mide la tasa de reacción LPS-LAL o el tiempo que precisa la reacción para alcanzar una densidad óptica específica. Sensibilidad: >0,005 UE/ml

  • Métodos ELISA e inmunoelectrofóresis de Rocket
El método ELISA de péptido C no competitivo y el Sándwich ELISA, que emplea anticuerpos monoclonales, son métodos excelentes, al igual que el método inmunoelectroforético de Rocket, que mide la absorción cuantitativa de coagulógeno usando anticuerpos de conejo contra la proteína. Sin embargo, los complicados procedimientos de larga duración para su establecimiento obstaculizan la extensión de su uso.

 

Mecanismos de interferencia de las pruebas LAL:

Condiciones pH no óptimas
Agregación y adsorción de un exceso de endotoxinas de control
Concentraciones de cationes inadecuadas
Modificación de la encima o la proteína
Activación de LAL no específico - frecuentes mecanismos de interferencia sin determinar

  • Método turbidimétrico cinético

  • Métodos cromogénico y turbidimétrico de punto final

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