O ensaio de endotoxinas

Fatos úteis sobre endotoxinas e sua detecção com os ensaios Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

As endotoxinas (lipopolissacarídeo, LPS) são produzidas exclusivamente por bactérias Gram-negativas, como Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa e muitas outras. A concentração de endotoxinas é expressa em UE.

1 UE = 100 pg de endotoxinas
1 picograma = 10-12 grama ou 0,000000000001 grama.

Para uma cepa específica de bactérias Gram-negativas, tem sido determinado que cerca de 7000 células bacterianas contêm 1 UE (Scan Dia Labs, dados não publicados).

Mecanismos de liberação de LPS de células bacterianas gram-negativas:
Morte celular natural e bacteriólise
Extravasamento de LPS através de bolhas ou liberação por vesículas membranosas
Liberação mediada por complemento e proteína sérica
Ingestão por fagócitos do hospedeiro com subsequente exocitose de LPS. Liberação mediada por antibióticos

Ensaios Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) para detecção de endotoxinas:

 Técnica Gel-Clot
Curto intervalo de sensibilidade e, no máximo, apenas semiquantitativa.
Máx. sensibilidade: 0,03 UE/mL.

Técnicas cromogênicas e desfecho-turbidimétricas
Os ensaios cromogênicos utilizam um peptídeo cromogênico sintético como substrato para a enzima coagulante no lugar do coagulogênio. O substrato cromogênico é hidrolisado pela enzima coagulante, liberando a região cromogênica terminal de cor amarela. Máx. sensibilidade >0,01 UE/mL. 

• Técnica cinética-turbidimétrica
Mede a velocidade da reação LAL-LPS ou o tempo necessário para que a reação atinja uma determinada densidade óptica. Quantitativa. Facilita a avaliação do aprimoramento/inibição da amostra.  Máx. sensibilidade: >0,005 UE/mL.

• Técnicas de ELISA e técnica de imunoeletroforese em foguete
ELISA não competitivo para peptídeo C e ELISA sanduíche que emprega anticorpos monoclonais e o ensaio de imunoeletroforese em foguete que mede o consumo quantitativo de coagulogênio utilizando anticorpos de coelho contra a proteína são todos distintos. No entanto, procedimentos com preparação complicada e demorada impedem o seu uso generalizado.

Mecanismos de interferência no ensaio LAL:
Condições de pH subótimas
Agregação ou adsorção de picos de endotoxinas de controle
Concentrações de cátions inadequadas
Modificação de enzima ou proteína
Ativação de LAL não específica - ocasionalmente, um mecanismo de interferência não pode ser determinado

 

 

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